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長(zhǎng)期應(yīng)激的不良反應(yīng)與神經(jīng)精神疾病的發(fā)病和惡化相關(guān)，慢性應(yīng)激暴露可顯著改變大腦功能，導(dǎo)致焦慮和抑郁等情緒癥狀。除情緒癥狀外，患者還常出現(xiàn)認(rèn)知缺陷等其他癥狀。應(yīng)激相關(guān)癥狀的多樣性對(duì)實(shí)現(xiàn)有效且持久的治療提出了挑戰(zhàn)。行為癥狀的多樣性提示，應(yīng)激下的不同表型可能由獨(dú)立的神經(jīng)環(huán)路元件介導(dǎo)。然而，目前尚不清楚不同腦區(qū)如何相互連接或這些環(huán)路如何導(dǎo)致特定的行為領(lǐng)域。因此，明確介導(dǎo)不同應(yīng)激相關(guān)癥狀的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制可能最終促進(jìn)創(chuàng)新治療策略的開(kāi)發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠基底前腦存在兩個(gè)不同的膽堿能亞群，分別投射至背側(cè)海馬（dorsal hippocampus, dHPC）和腹側(cè)海馬（ventral hippocampus, vHPC）。這些亞群在輸入組織、電生理特性、轉(zhuǎn)錄組特征以及對(duì)刺激正負(fù)效價(jià)的響應(yīng)上均存在顯著差異，并分別主導(dǎo)認(rèn)知與情緒的調(diào)控。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠焦慮水平升高及認(rèn)知功能受損，同時(shí)伴隨vHPC膽堿能投射增強(qiáng)和dHPC投射抑制。通過(guò)化學(xué)遺傳學(xué)激活dHPC投射或抑制vHPC投射，可有效緩解應(yīng)激誘導(dǎo)的行為異常。此外，聯(lián)合使用乙酰膽堿酯酶抑制劑多奈哌齊（donepezil）與vHPC區(qū)M1型毒蕈堿受體阻斷劑，能夠同時(shí)逆轉(zhuǎn)應(yīng)激引發(fā)的上述表型。這些數(shù)據(jù)揭示了不同的隔海馬膽堿能環(huán)路在應(yīng)激下獨(dú)立介導(dǎo)特定癥狀的機(jī)制，為基于環(huán)路靶向治療應(yīng)激相關(guān)精神疾病提供了新策略。

1. MS/vDB ChAT神經(jīng)元傳遞負(fù)性效價(jià)信號(hào)

作者在ChAT-ires-Cre小鼠中通過(guò)病毒表達(dá)Cre依賴的GCaMP6m鈣指示劑，并使用置于MS/vDB上方的光纖記錄熒光信號(hào)變化（圖1A）。組織學(xué)分析顯示，在鈣成像實(shí)驗(yàn)中，超過(guò)90%的GCaMP6m表達(dá)細(xì)胞與MS/vDB中的ChAT陽(yáng)性細(xì)胞共定位（圖1A）。

作者首先檢測(cè)了在厭惡刺激下GCaMP6m熒光強(qiáng)度的變化。電擊后和尾部束縛測(cè)試（TRT）中GCaMP6m信號(hào)迅速增強(qiáng)（圖1B、C），表明神經(jīng)元對(duì)物理刺激的反應(yīng)增強(qiáng)（圖1F、G）。隨后，通過(guò)口腔導(dǎo)管向小鼠灌注奎寧溶液（5 mM，10 μl/0.5 s）（圖1H），奎寧給藥顯著增強(qiáng)GCaMP6m熒光強(qiáng)度（圖1H、I）。

通過(guò)光遺傳學(xué)激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元，作者研究了其在實(shí)時(shí)位置回避（RTPA）中的作用。藍(lán)光刺激可有效激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元（圖2B）。與對(duì)照組相比，ChR2表達(dá)動(dòng)物對(duì)刺激室的偏好降低（圖2C），且在刺激側(cè)運(yùn)動(dòng)活性增加（圖2D）。通過(guò)巴甫洛夫條件性位置厭惡實(shí)驗(yàn)評(píng)估光激活誘導(dǎo)的長(zhǎng)期學(xué)習(xí)關(guān)聯(lián)（圖2E）。這些結(jié)果支持MS/vDB ChAT神經(jīng)元激活編碼負(fù)性效價(jià)。

圖1. 厭惡刺激引起MS/vDB ChAT神經(jīng)元活動(dòng)

圖2. 激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元誘導(dǎo)位置回避

2. MS/vDB ChAT神經(jīng)元處理并調(diào)控焦慮狀態(tài)

上述發(fā)現(xiàn)提示MS/vDB ChAT神經(jīng)元活性增強(qiáng)可誘發(fā)動(dòng)物的防御反應(yīng)。為探究其在自發(fā)回避行為中的作用，作者在高架十字迷宮（EPM）中記錄其活性。小鼠進(jìn)入焦慮性開(kāi)放臂前，MS/vDB ChAT神經(jīng)元活性升高，并在探索開(kāi)放臂期間持續(xù)增強(qiáng)（圖3A-C），表明這些神經(jīng)元更傾向于編碼焦慮相關(guān)特征。

僅在開(kāi)放臂探索時(shí)抑制MS/vDB ChAT神經(jīng)元，可顯著延長(zhǎng)小鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間（圖3F），而閉合臂抑制無(wú)此效應(yīng)（圖3G）。光激活MS/vDB ChAT神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)ChR2組小鼠開(kāi)放臂探索時(shí)間和進(jìn)入次數(shù)減少（圖3I-K），OFT測(cè)試中中心探索時(shí)間減少（圖3L-M）。這些結(jié)果表明，MS/vDB ChAT神經(jīng)元活性可作為焦慮狀態(tài)的信號(hào)和調(diào)控因子。

圖3. MS/vDB ChAT神經(jīng)元處理和調(diào)節(jié)類焦慮行為

3. MS/vDB ChAT神經(jīng)元存在投射至dHPC和vHPC的獨(dú)特亞群

為了確定投射到dHPC和vHPC的MS/vDB ChAT神經(jīng)元是否為同一實(shí)體或不同實(shí)體，作者將Cre誘導(dǎo)的、逆行運(yùn)輸?shù)牟《据d體分別注射到背側(cè)CA1（dCA1）（AAVretro-Dio-EYFP）和腹側(cè)CA1（vCA1）（AAVretro-Dio-mCherry）中（圖4B）。作者觀察到投射到dCA1和vCA1區(qū)域的神經(jīng)元群體有明顯的，且?guī)缀鯖](méi)有重疊（圖4C）。

作者隨后檢查了這些不同亞群的ChAT神經(jīng)元的輸出區(qū)域（圖4G）。對(duì)海馬內(nèi)軸突纖維的分析顯示，投射到dCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元以相似的程度投射到dCA1、背側(cè)齒狀回（dDG）和dCA3，而投射到vCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元主要支配vCA1和vCA3（圖4H）。由于dCA1或vCA1投射的MS/vDB ChAT神經(jīng)元在海馬中的靶點(diǎn)可以分為背側(cè)和腹側(cè)兩組，因此，投射到dCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元將被稱為ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元，投射到vCA1的MS/vDB ChAT神經(jīng)元將被稱為ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元。

圖4. 不同亞群的MS/vDB ChAT神經(jīng)元投射到dCA1和vCA1

4. MS/vDB膽堿能輸入分別調(diào)控vHPC和dHPC介導(dǎo)的焦慮樣行為與空間學(xué)習(xí)

作者接下來(lái)研究了來(lái)自MS/vDB到vHPC的膽堿能纖維的活動(dòng)（圖5A）。組織學(xué)分析顯示，在MS/vDB中，超過(guò)90%的GCaMP6s陽(yáng)性細(xì)胞與ChAT陽(yáng)性細(xì)胞共定位（圖5B）。在vHPC區(qū)域上方植入了光纖（圖5C）。來(lái)自EPM的記錄數(shù)據(jù)顯示，在小鼠進(jìn)入開(kāi)放臂之前，MS/vDB-vHPC ChAT纖維迅速激活，并且在小鼠探索開(kāi)放臂期間這些纖維表現(xiàn)出更高的活動(dòng)性（圖5D和E）。

結(jié)果表明，在開(kāi)放臂探索期間，而不是在封閉臂探索期間，選擇性抑制來(lái)自MS/vDB-vHPC的膽堿能投射，有效地減輕了EPM中的開(kāi)放臂回避行為（圖5G和H）。綜上所述，這些觀察結(jié)果表明，MS/vDB對(duì)vHPC區(qū)域的膽堿能輸入通過(guò)釋放ACh調(diào)節(jié)焦慮樣行為。同樣的道理，MS/vDB-dHPC的膽堿能投射可以獨(dú)立介導(dǎo)焦慮樣行為和空間學(xué)習(xí)。

圖5. MS/vDB對(duì)vHPC和dHPC的膽堿能輸入分別調(diào)節(jié)類焦慮行為和空間學(xué)習(xí)

5. 慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)ChATMS/vDB-dHPC和ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的電生理與轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性差異

作者研究了在病理性應(yīng)激下，ChATMS/vDB-dHPC和ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的活動(dòng)是否發(fā)生了改變。在應(yīng)激小鼠中，由去極化引起的ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的放電活動(dòng)顯著增加（圖6B）。并證明慢性應(yīng)激損害了ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元的固有興奮性（圖6C和D）?？傮w而言，作者的電生理學(xué)發(fā)現(xiàn)表明，接受慢性應(yīng)激的動(dòng)物表現(xiàn)出增強(qiáng)的ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元活動(dòng)和降低的ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元活動(dòng)。慢性應(yīng)激后，在ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元中，8個(gè)離子通道基因上調(diào)，5個(gè)離子通道基因下調(diào)。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激后電生理變化的機(jī)制可能涉及差異表達(dá)的候選離子通道基因。

圖6. ChATMS/vDB-dHPC與ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元對(duì)慢性束縛應(yīng)激表現(xiàn)出差異化的電生理及轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性

6. 調(diào)控特定隔海馬膽堿能環(huán)路可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激誘導(dǎo)的癥狀

為了進(jìn)一步研究慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的ChATMS/vDB-vHPC神經(jīng)元的過(guò)度活躍和ChATMS/vDB-dHPC神經(jīng)元的遲緩是否分別導(dǎo)致焦慮水平升高和認(rèn)知功能障礙，作者通過(guò)化學(xué)遺傳學(xué)手段拮抗這兩條通路中的變化?；瘜W(xué)遺傳學(xué)激活MS/vDB-dHPC膽堿能投射緩解了在Morris水迷宮（MWM）中觀察到的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的下降（圖7C至F）。另一方面，通過(guò)hM4Di抑制MS/vDB-vHPC膽堿能投射逆轉(zhuǎn)了應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮樣行為（圖7G至K）。這些數(shù)據(jù)表明，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的不同隔海馬膽堿能回路的異常活動(dòng)可能分別調(diào)節(jié)情緒和認(rèn)知障礙。

圖7. 操縱不同的中隔-海馬膽堿能通路可以挽救由慢性壓力引起的記憶缺陷和焦慮樣行為

7. AChEIs聯(lián)合阻斷M1可改善應(yīng)激小鼠的認(rèn)知缺陷和焦慮樣行為

作者接下來(lái)研究了是否可以通過(guò)靶向基于回路的膽堿能信號(hào)通路來(lái)挽救應(yīng)激誘導(dǎo)的行為缺陷。通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗記錄檢查M1和M3受體對(duì)這兩種投射介導(dǎo)的突觸傳遞的作用（圖8A和C）。光誘導(dǎo)的ACh釋放引發(fā)了dCA1和vCA1錐體細(xì)胞中的煙堿型內(nèi)向電流和毒蕈堿型內(nèi)向電流（圖8B和D）。在vCA1區(qū)域，M1受體拮抗劑（M1i）而非M3受體拮抗劑（M3i）抑制了光誘導(dǎo)的毒蕈堿型內(nèi)向電流（圖8B）。在dCA1區(qū)域，毒蕈堿型內(nèi)向電流可以被M3i或M1i抑制（圖8D）。這些觀察結(jié)果表明，M1受體對(duì)于MS/vDB-vHPC膽堿能通路至關(guān)重要，而dCA1膽堿能投射的突觸后興奮性效應(yīng)由M1和M3受體共同介導(dǎo)。

接下來(lái)，作者研究了多奈哌齊和M1i的聯(lián)合應(yīng)用是否可以改善應(yīng)激小鼠的認(rèn)知和情緒障礙（圖8E）。在EPM測(cè)試中，作者觀察到多奈哌齊的給藥加劇了應(yīng)激小鼠的焦慮狀態(tài)。然而，單獨(dú)或與多奈哌齊聯(lián)合將M1i注入vHPC區(qū)域，有效地改善了應(yīng)激小鼠的焦慮樣行為（圖8F和G）。在Morris水迷宮（MWM）測(cè)試中，單獨(dú)或與M1i聯(lián)合給藥多奈哌齊改善了應(yīng)激誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙；然而，在接受M1i注入vHPC區(qū)域的應(yīng)激組中未觀察到改善（圖8H至K）。因此，這些結(jié)果表明，多奈哌齊和M1的聯(lián)合給藥可以有效地逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激引起的情緒和認(rèn)知缺陷。

圖8. 乙酰膽堿酯酶聯(lián)合阻斷M1受體可改善應(yīng)激小鼠的認(rèn)知缺陷和焦慮樣行為

結(jié)論

通過(guò)靶向膽堿能信號(hào)通路，作者可以改善應(yīng)激誘導(dǎo)的情緒和認(rèn)知障礙。這些發(fā)現(xiàn)可能為開(kāi)發(fā)針對(duì)應(yīng)激相關(guān)障礙的特定回路的治療方法提供見(jiàn)解。此外，對(duì)膽堿能回路的侵入性調(diào)節(jié)需要進(jìn)一步研究如何通過(guò)藥物靶向dHPC和vHPC中不同的ACh受體，以治療應(yīng)激相關(guān)的情緒和認(rèn)知缺陷。

MORRIS水迷宮

Morris水迷宮（ MWM）實(shí)驗(yàn)是一種強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（大鼠、小鼠）游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺(tái)的一種實(shí)驗(yàn)，主要用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置感和方向感（空間定位）的學(xué)習(xí)記憶能力。